尼罗罗非鱼dnd和aldhla2基因在生殖细胞发育过程中的功能研究

【摘要】原始生殖细胞(Primordialgermcells,PGCs)经过迁移进入生殖腺原基后,经过增殖、分化为精原细胞和卵原细胞。鱼类生殖细胞在性别分化过程中起到了重要作用,以尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)作为研究鱼类性别决定与分化的实验动物,研究生殖细胞有助于从另一角度阐明其性别决定与分化的机制。dnd(deadend)同vasa基因一样是生殖细胞的标记基因,对于脊椎动物PGCs的发育和配子生成有重要作用。在PGCs分化为卵原细胞和精原细胞之后需进行减数分裂产生卵子和精子,然而在不同物种,雌、雄生殖细胞减数分裂起始时间是不同的,这一过程对其生殖发育有着重要的作用。多年的研究证实了视黄酸(Retinoicacid,RA)信号通路在减数分裂起始中有重要作用,Stra8(Stimulatedbyretinoicacidgene8)是这一信号通路中的关键因子。然而这一机制仅在四足动物中如哺乳类、鸟类和两栖类得到证实,RA信号通路在硬骨鱼类生殖细胞减数分裂起始过程中的作用还有待阐明。本实验室首次报道南方鲇中存在Stra8并证实RA可能参与硬骨鱼类减数分裂起始,这些对于探究RA在硬骨鱼减数分裂起始中的作用提供了依据。尼罗罗非鱼雌、雄性腺中的生殖细胞减数分裂起始时间有明显不同(雌鱼30dah左右,雄鱼75dah左右)(dah,daysafterhatching),是研究RA在硬骨鱼类减数分裂起始过程中作用的好材料。本论文主要应用CRISPR/Cas9(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associated9)基因敲除技术,初步探究了尼罗罗非鱼dnd和RA合成酶aldhla2(Aldehydedehydrogenasefamily1,subfamilyA2)在生殖细胞发育过程中的功能。主要结果如下：氨基酸比对分析表明,罗非鱼的dnd基因在进化上十分保守。组织分布分析表明dnd只在性腺中表达,并且卵巢中的表达量高于精巢,这与转录组的数据是一致的。应用CRISPR/Cas9基因敲除技术,能成功将dnd敲除,得到当代(GO)嵌合体,但是效率不高,这个可能与靶点选择和注射的剂量有关。组织学检测表明,与对照相比,敲除鱼的卵巢中生殖细胞大量减少,只有少量的卵原细胞,并且有大的空腔产生：敲除dnd的XY精巢中没有生殖细胞,但在形态上与正常精巢基本无差异,中间有空洞产生。免疫组化结果表明,在敲除XX性腺中,存在少量的Vasa信号,说明生殖细胞没有完全被敲除；只在血管附近检测到Cyp19alai(雌激素合成酶)的信号,说明雌激素合成较少；Dmrt1(精巢分化和维持的关键基因,特异表达于Sertoli细胞)和Cypllb2(性激素合成的关键酶,特异表达十Leydig细胞)有少量表达,说明生殖细胞缺失的XX性腺的体细胞有雄性化趋势。在敲除雄性个体中,没有检测到Vasa信号,生殖细胞完全缺失；Cypl9ala没有表达,Dmrt1和Cypllb2表达与对照相同,表明生殖细胞缺失对XY性腺体细胞分化无影响。这说明了生殖细胞能够控制罗非鱼性别分化。应用制备的罗非鱼Aldh1a2抗体,通过免疫组化检测其蛋白水平表达情况发现,Aldh1a2在雌、雄性腺的体细胞中表达,并在性腺发育的后期高表达。用RA合成酶类的广谱性抑制剂DEAB(4-diethylaminobenzaldehyde,对二乙氨基苯甲醛)拌食饲料投喂雌性罗非鱼,此外还用CRISPR/Cas9基因敲除技术敲除aldh1a2,分别从两个方面抑制性腺中内源RA的合成。组织学观察表明,在30日龄时,对照组已经在进行减数分裂,而敲除组和处理组的性腺还处于未分化的状态；在60日龄时,对照组已经发育成充满II时相卵母细胞的卵巢结构,处理组与敲除组才刚开始进行减数分裂;75日龄时,处理组与敲除组已形成卵母细胞。这些说明雌性性腺中RA量的减少影响了生殖细胞减数分裂的起始。用DEAB处理到90日龄时,性腺中有正常的卵母细胞产生,但是卵母细胞个数较少,卵巢横切面中多则四五个,少的一两个。说明RA影响了卵细胞的发育,其合成的量的减少可能引起雌性生殖细胞发育不正常,有可能使雌性产卵量降低。在敲除了dnd导致生殖细胞缺失的性腺中,用免疫组织化学检测Aldh1a2的表达情况,结果发现体细胞中Aldh1a2的表达未受到影响,表明表达于体细胞的Aldh1a2是独立于生殖细胞的。综上所述,罗非鱼的dnd基因具有保守的功能,是其生殖细胞发育所必须的;在缺失了生殖细胞的XX,其性别发育方向发生改变,即雄性化；生殖细胞缺失对XY性腺体细胞分化无影响。从而证实了生殖细胞是罗非鱼卵巢分化所必需。RA主要合成酶Aldhla2在性腺体细胞中表达并独立于生殖细胞；RA同样对生殖细胞的发育具有重要作用：能够影响雌性生殖细胞减数分裂起始并影响卵母细胞的发育,从而更进一步证明RA在脊椎动物减数分裂起始中作用的保守性。
【作者】方玲玲；
【导师】王德寿；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】尼罗罗非鱼；生殖细胞；减数分裂；CRISPR/Cas9基因敲除；dnd；aldhIa2；

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